水性涂料已經(jīng)成為殺菌劑制造商的重要市場(chǎng)。但是，隨著法律對(duì)可使用的殺菌劑種類和量的控制越來越嚴(yán)格，涂料產(chǎn)品防腐變得更加具有挑戰(zhàn)性。這包括對(duì)甲醛釋放劑、對(duì)異噻唑啉酮，以及對(duì)重金屬（例如鉻）在涂料產(chǎn)品中的含量限制越來越苛刻。使用這些產(chǎn)品的公司一直在努力尋找符合新法規(guī)的方法，同時(shí)還要向其客戶提供優(yōu)質(zhì)的無微生物產(chǎn)品。涂料行業(yè)對(duì)傳統(tǒng)殺菌劑的關(guān)注，導(dǎo)致業(yè)界始終認(rèn)為不會(huì)有新的活性劑出現(xiàn)，但是生物基添加劑提供了扭轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)的解決方案。如果僅使用生物添加劑不足以消除所有微生物污染，則可以協(xié)同使用它們，以降低所需傳統(tǒng)殺菌劑的量。通過應(yīng)用生物技術(shù)和分子生物學(xué)方法，可以進(jìn)一步降低使用量。此外，通過利用這些安全有效的生物添加劑的潛力，制造商可以擴(kuò)展到他們可能尚未考慮的市場(chǎng)。本文介紹了生物技術(shù)在涂料防腐中的應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)減少或消除傳統(tǒng)殺菌劑的使用這一目標(biāo)。

在過去的幾十年中，因?yàn)槿軇┬屯苛系谋壤粩鄿p少，以及市場(chǎng)對(duì)低VOC涂料需求的增長(zhǎng)，水性涂料已成為殺菌劑制造商的一個(gè)有利可圖的市場(chǎng)。隨之而來的是，越來越多水基系統(tǒng)中的微生物污染和腐敗急需控制，因?yàn)檫@些水性環(huán)境和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源提供了非常適合微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。然而，關(guān)于所使用的殺菌劑的健康問題，以及對(duì)傳統(tǒng)殺菌劑類型和濃度的限制日益嚴(yán)格制，對(duì)開發(fā)新型和低毒性防腐劑的需求日益增強(qiáng)。

不同的微生物類群對(duì)涂料性能會(huì)產(chǎn)生不同的負(fù)面影響。由于這個(gè)原因，常規(guī)殺菌劑根據(jù)其在液態(tài)罐內(nèi)和干膜產(chǎn)品中的使用而有所不同?？刂萍?xì)菌對(duì)于罐內(nèi)保存更加重要，而真菌和藻類則是干膜的最大威脅。在考慮使用防污系統(tǒng)時(shí)，微生物和大型底棲動(dòng)物都要考慮到。在水性體系中，微生物的生長(zhǎng)會(huì)水解組分，降低pH值，產(chǎn)生氣體、惡臭，使薄膜內(nèi)的產(chǎn)品變色并降低粘度，從而影響涂層質(zhì)量。

被批準(zhǔn)可用于罐內(nèi)保存的傳統(tǒng)殺菌劑通常包括甲醛釋放劑、異噻唑啉酮衍生物以及溴化和其他鹵化化合物。這些通常與諸如氨基甲酸酯、季胺、苯基脲衍生物和重金屬之類結(jié)合使用，以保持干膜的保存和防污性能。殺菌活性的機(jī)制各不相同，包括由于烷基化劑、交聯(lián)劑、親電物質(zhì)、膜破壞劑以及自由基和活性氧的釋放劑所引起的影響。其中一些對(duì)人類有直接的影響（例如烷基化劑和交聯(lián)劑），另一些如異噻唑啉酮類對(duì)人類的直接毒性較低，但在持續(xù)接觸后可能引起過敏。這些及其他健康風(fēng)險(xiǎn)以及潛在的環(huán)境影響促使許多國(guó)家限制其含量和使用（或需要特殊標(biāo)簽）。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?表1. 常用傳統(tǒng)殺菌劑的實(shí)例

表1列出了一些常見的傳統(tǒng)殺菌劑。許多罐內(nèi)防腐劑均包含2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MIT）或其異噻唑啉酮衍生物之一，構(gòu)成了諸如Kathon1.5和Rocima之類的品牌產(chǎn)品，法規(guī)對(duì)所有這些成份的使用和用量的限制在不斷的嚴(yán)格化。從對(duì)甲醛釋放劑和皮膚增敏劑的健康擔(dān)憂，到繼歐洲標(biāo)準(zhǔn)提高后（例如REACH和2013年的EUBiocides法規(guī)BPR法案）美國(guó)的反應(yīng)，以及有人一直呼吁避免在建筑產(chǎn)品中完全使用殺菌劑，這些因素持續(xù)續(xù)給行業(yè)帶來壓力。為解決這些日益嚴(yán)峻的監(jiān)管難題，但同時(shí)仍要為水性涂料提供所需的保護(hù)，需要新穎的方法出現(xiàn)。

生物基分子的例子包括如溶菌酶和葡萄糖氧化酶之類的酶，活性與天然抗菌肽比如防御素相似但分子量較小的小肽，甚至是含有此類分子的整個(gè)細(xì)胞?？梢栽谝后w和干膜包衣系統(tǒng)中通過保留這些分子的自然生物學(xué)功能實(shí)現(xiàn)直接抗菌或是與傳統(tǒng)殺菌劑的協(xié)同抗菌。

本文描述了使用快速分子技術(shù)來選擇生物分子實(shí)現(xiàn)安全有效地控制微生物污染，并且這些生物分子還可以與現(xiàn)有殺菌劑協(xié)同使用，來降低此類傳統(tǒng)殺菌劑的用量。

分子技術(shù)在篩選生物基添加劑作為罐內(nèi)防腐劑中的應(yīng)用

我們根據(jù)抗菌特性，從肽庫中選擇出了長(zhǎng)度為6-7個(gè)氨基酸（分子量低于1000g/mol）的小肽AMP-6和AMP-7。該數(shù)據(jù)庫是使用組合合成方法創(chuàng)建的，可產(chǎn)生超過5300萬種可能的肽，能夠針對(duì)特定的抗菌活性進(jìn)行篩選。

圖1A. 肽組合數(shù)據(jù)庫和抗菌活性。迭代氨基酸取代和相關(guān)的對(duì)鐮刀菌的最低抑菌濃度（MIC）。

圖1A顯示了用于生成數(shù)據(jù)庫的迭代氨基酸替代過程的示例以及針對(duì)常見絲狀真菌鐮刀菌的最小抑制劑濃度（MIC）。通過改變肽序列，可以“調(diào)節(jié)”針對(duì)特定目標(biāo)微生物群的活性，例如對(duì)細(xì)菌對(duì)真菌和霉菌。使用組合化學(xué)方法，隨著肽化學(xué)結(jié)構(gòu)變得更加明確（在這種情況下為6個(gè)氨基酸鏈），殺死同一靶標(biāo)微生物所需的濃度逐漸降低。在AMP-6（6-氨基酸肽）的情況下，對(duì)真菌的活性（由較低的MIC數(shù)表示）比所測(cè)試的細(xì)菌（需要更高的濃度）更高。僅添加一個(gè)氨基酸，AMP-7就對(duì)細(xì)菌和真菌均顯示出令人滿意的活性（圖1B）。

圖1B. 兩種肽AMP-6和AMP-7之間的抗菌活性差異。數(shù)字表示針對(duì)所測(cè)試細(xì)菌和真菌的MIC。

◆分子生物學(xué)技術(shù)將測(cè)試時(shí)間縮短至數(shù)分鐘而不是數(shù)周

使用基于分子的微生物生存力分析（例如XTT分析）可以快速評(píng)估候選抗微生物劑的作用。17XTT是四唑鎓染料（2,3-雙-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑鎓-5-羧苯胺）被代謝活躍細(xì)胞還原為有色產(chǎn)物（較暗的紅棕色孔），與經(jīng)過熱殺死或用乙醇處理的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞仍保持較淺的黃色（圖2A）。可以使用分光光度計(jì)測(cè)量吸收光譜的差異，并快速評(píng)估細(xì)胞群體的生存能力。應(yīng)用這些檢測(cè)方法，有可能篩選抗微生物對(duì)特定污染微生物的選擇性，而不是使用具有廣泛毒性的殺菌劑。

圖2A. 使用XTT活力測(cè)定法篩選生物添加劑，XTT通過活細(xì)胞生產(chǎn)可量化的甲?衍生物。

圖2B顯示，控制假單胞菌的不同污染菌株所需的生物添加劑的濃度可能會(huì)發(fā)生巨大變化。對(duì)于惡臭假單胞菌，幾種藥物在各種濃度下均有效（如新陳代謝的降低百分比更高），而銅綠假單胞菌則需要更高濃度的測(cè)試生物添加劑（藍(lán)條）。

圖2B-1. 生物添加劑對(duì)銅綠假單胞菌的假單胞菌的抗菌活性。更高的代謝減少百分比等于更高的功效。

圖2B-2. 生物添加劑對(duì)惡臭假單胞菌的假單胞菌的抗菌活性。更高的代謝減少百分比等于更高的功效。

與現(xiàn)有傳統(tǒng)殺菌劑的協(xié)同活性

根據(jù)最初的XTT篩選結(jié)果，評(píng)估了兩種常見的殺菌劑與這些生物基藥劑的協(xié)同活性：異噻唑啉酮（MIT）和甲醛釋放劑1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲（DMDM）（圖3）。

圖3. 與傳統(tǒng)殺菌劑MIT和DMDM結(jié)合使用時(shí)，對(duì)所選生物添加劑的抗微生物活性的評(píng)估。 藍(lán)色條表示未添加傳統(tǒng)殺生物劑，橙色條表示添加了15 ppm DMDM，黃色條表示添加了15 ppm MIT和指定濃度的葡萄 糖氧化酶或AMP-7。

用于評(píng)估生物添加劑和殺菌劑的是六種常見的細(xì)菌變質(zhì)劑的混合接種測(cè)試板，包括幾種假單胞菌和其他革蘭氏陰性菌（如腸桿菌和革蘭氏陽性芽孢桿菌）。在第一欄中，這些試劑在15ppm時(shí)才有效（15ppm是標(biāo)記為皮膚敏化劑的臨界值也是更嚴(yán)格的EUH208“可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)”的規(guī)定值）。在這次分析中，當(dāng)濃度為15ppm時(shí)，幾乎沒有抑制作用（新陳代謝僅降低了約15％），但是當(dāng)與特定的生物基添加劑結(jié)合使用時(shí)，效果會(huì)有所提高（從15％到超過70％，這與在熱滅活的細(xì)胞中觀察到的相當(dāng)）。特別是具有葡萄糖氧化酶的協(xié)同活性，可以達(dá)到15ppm的有效殺滅率。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化和隨后釋放的過氧化氫，會(huì)引起細(xì)胞損傷。葡萄糖氧化酶被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）列為各種預(yù)期用途的公認(rèn)安全（GRAS），在食品工業(yè)中經(jīng)常使用。它以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，并且可以批量購(gòu)買。通過在XTT分析中測(cè)試各種濃度的葡萄糖氧化酶和MIT證實(shí)了這種明顯的協(xié)同活性。

圖4A. 葡萄糖氧化酶和MIT組合的生長(zhǎng)抑制和協(xié)同分 析。顯示了不同濃度的葡萄糖氧化酶和MIT的組合的響應(yīng)（以生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù)表示）的熱圖。

測(cè)試板上細(xì)菌對(duì)葡萄糖氧化酶和MIT各種組合的反應(yīng)顯示如圖4A所示，該圖用顏色表達(dá)響應(yīng)度，紅色是生長(zhǎng)抑制率最高，綠色是生長(zhǎng)抑制率最低。為了測(cè)試這兩種化合物之間是否存在拮抗作用或協(xié)同作用，通過零相互作用力（ZIP）方法，將葡萄糖氧化酶和MIT組合的響應(yīng)用于確定協(xié)同作用得分，基于實(shí)際響應(yīng)與預(yù)期響應(yīng)的偏差得到評(píng)估分?jǐn)?shù)。

圖4B. 葡萄糖氧化酶和MIT組合的協(xié)同作用得分的等高線圖，其中正得分（紅色）表示協(xié)同作用，負(fù)得分（綠色）表示拮抗作用，零得分（白色）表示累加反 應(yīng)。

在等高線圖中以可視化方式顯示每個(gè)組合（圖4B）的得分，結(jié)果表明兩種抗菌素通常以協(xié)同方式相互作用。葡萄糖氧化酶的濃度在50~500ppm之間，而MIT的濃度在0.15~1ppm以下時(shí)，存在協(xié)同作用區(qū)域，葡萄糖氧化酶濃度在10~1,000ppm之間以及MIT濃度在7~15ppm以下范圍內(nèi)時(shí)可以看到最大的協(xié)同作用。這表明葡萄糖氧化酶和MIT在低濃度和高濃度下都可以相互補(bǔ)充，從而達(dá)到降低MIT的水平并且顯示有效的抗菌活性的目的。

使用ASTMD2574評(píng)估傳統(tǒng)殺菌劑和葡萄糖氧化酶的協(xié)同作用

使用快速分子技術(shù)檢測(cè)葡萄糖氧化酶的抗菌活性，使用傳統(tǒng)的測(cè)試方法ASTMD2574油漆腐敗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步測(cè)試作為罐裝涂料防腐劑的防腐性能。通過使用上述分子方法快速篩選目標(biāo)微生物，選擇經(jīng)典測(cè)試（例如ASTMD2574），挑中最有希望的候選對(duì)象。

圖5. 第七天 ASTM D2574 結(jié)果的示例照 片。

使用不含殺菌劑的丙烯酸膠乳（請(qǐng)參閱附錄-配制材料和方法），使用和XTT分析使用的防腐敗劑測(cè)試板一樣的測(cè)試板；在七天內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)。用于ASTMD2574的所選葡萄糖氧化酶劑量基于XTT分析的結(jié)果，其中50ppm顯示與MIT和DMDM協(xié)同作用，而5ppm僅與DMDM協(xié)同作用。圖5顯示了最后一天的生物基添加劑和傳統(tǒng)殺菌劑的測(cè)試板。在為期7天的監(jiān)測(cè)期內(nèi)，無殺菌劑的乳膠樣品每天得分均為4（完全過度生長(zhǎng)）。

? ? ? ? ?? ? 表2. ASTM D2547不含殺菌劑的丙烯酸乳膠的挑戰(zhàn)結(jié)果

推薦劑量的MIT和DMDM在第1天評(píng)分達(dá)到了0（無增長(zhǎng)），而較低的15ppm劑量DMDM的效果較差，在第7天仍顯示4，MIT在第5天仍未達(dá)到0。但是，在使用不含殺菌劑的膠乳的ASTM方法中，最低的葡萄糖氧化酶測(cè)試濃度（50ppm）在第1天達(dá)到了0，而與15ppm的MIT或DMDM結(jié)合使用時(shí)，在第1天也達(dá)到了0（表2）。

雖然單獨(dú)使用葡萄糖氧化酶顯示出如此高的活性是一個(gè)積極的結(jié)果，但為了表征在丙烯酸乳膠中與傳統(tǒng)殺菌劑的任

檢測(cè)和消除油漆變質(zhì)劑的分子方法

雖然像ASTMD2574這樣的經(jīng)典測(cè)試方法可以確定殺死所有挑戰(zhàn)性生物的廣譜抗毒性試劑，他們無法選擇性地鑒定出對(duì)特定菌株有效的藥物。通過使用DNA測(cè)序方法，可以特異性地識(shí)別哪些細(xì)菌被特定的生物基添加劑殺死以進(jìn)行精確處理（圖6A）。

圖6A. 使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和測(cè)序?qū)Ω瘮∥⑸镞M(jìn)行分子檢測(cè)。 測(cè)序結(jié)果與目測(cè)觀察結(jié)果的比較。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）用于直接分析涂料中的微生物污染并鑒定特定污染物。圖6B顯示了使用選擇性探針鑒定特定細(xì)菌種類的結(jié)果。當(dāng)菌株特異性探針成功擴(kuò)增靶DNA，熒光明顯增加。這方法也可以用于確定污染水平。

圖6B. 使用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)特定微生物和污染水平。

圖6C顯示了使用腸桿菌的劑量反應(yīng)曲線，顯示了在不同濃度下擴(kuò)增所需要的循環(huán)次數(shù)的變化。通過確定細(xì)菌污染的具體水平并進(jìn)行相應(yīng)的處理，減少了在產(chǎn)品中使用高劑量的廣譜毒性殺菌劑的需求。

圖6C. 使用腸桿菌的劑量反應(yīng)曲線。

使用基于生物的添加劑擴(kuò)大市場(chǎng)：食品安全和對(duì)抗抗生素耐藥性

使用一些具有多種應(yīng)用GRAS認(rèn)證的低毒性生物基添加劑，制造商可以拓展罐裝涂料防腐劑以外的新市場(chǎng)——例如食品包裝?；谝种骗傊桨迳衔⑸锞湫纬傻目焖俸Y選技術(shù)被用于尋找抗大腸桿菌的活性劑以及探索活性劑之間的任何潛在協(xié)同作用。

圖7A顯示了涂有聚乙烯醇（PVA）的2.5厘米聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）小切口的圖像，該切口摻入了用于測(cè)試瓊脂平板上污染物抑制（在此情況下為大腸桿菌）的生物添加劑。隨著每種藥物濃度的增加，觀察到生長(zhǎng)受到抑制，可以通過塑料下可見菌落數(shù)量的減少來衡量。通過將兩種試劑結(jié)合，可以進(jìn)一步降低所需的每種試劑的濃度。

圖7A. 用于篩選食品包裝生物添加劑的方 法。接觸帶涂層的圓盤后大腸桿菌的生長(zhǎng)（如細(xì)菌菌落所 示）。與具有增加的 AMP-7或殼聚糖濃度的涂層圓盤接觸后， 大腸桿菌的生長(zhǎng)（如 細(xì)菌菌落所示）。涂 膜盤下方的透明區(qū)域表示缺乏細(xì)菌生長(zhǎng)。

根據(jù)這些結(jié)果，使用食品模擬肉餅（帶有細(xì)胞生長(zhǎng)顏色指示劑的微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的測(cè)試，可以用測(cè)試微生物對(duì)其進(jìn)行挑戰(zhàn)，然后使用生物添加劑涂層的密封塑料本身進(jìn)行真空密封，或?qū)⑵鋳A在具有生物添加劑涂層的插入件之間，以防止食源性污染（圖7C）。如圖7B中所示，在包裝涂層中最佳劑量的生物添加劑時(shí)，大腸桿菌的生存力降低至零（無菌落）。

圖7B.瓊脂平板顯示大腸桿菌的生長(zhǎng)，并被殼聚糖和 AMP-7組合抑制生長(zhǎng)。

市場(chǎng)拓展的其他案例包括推出有助于解決日益增長(zhǎng)的全球醫(yī)療保健問題：抗生素抗藥性的產(chǎn)品。不僅需要安全有效的抗菌劑（例如上述基于生物的藥劑），而且還需要對(duì)抗抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移的方法（當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，DNA溢出并可以被其他細(xì)胞吸收）。

圖7C. 食品包裝測(cè)試系統(tǒng)示意圖。

目前已經(jīng)成功創(chuàng)建了酶促涂層表面，在被其他細(xì)胞吸收之前可以降解并破壞從細(xì)胞中溢出的無細(xì)胞DNA。

圖8左上方的測(cè)試板顯示出了AMP-7（總固形物的3％）對(duì)大腸桿菌的有效殺滅，將其放置在受污染的瓊脂平板上時(shí)，與對(duì)照相比，AMP-7聚氨酯切口邊緣周圍缺乏細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)指征。圖8中間的測(cè)試板顯示了含有核酸酶DNaseI（總固體含量1.5％）的聚氨酯涂層對(duì)DNA的破壞。此處使用的DNA帶有對(duì)氨芐西林（一種與青霉素有關(guān)的β-內(nèi)酰胺抗生素）具有抗性的基因。暴露后，將DNA從涂層表面重懸并進(jìn)行分析。在圖8中間圖的兩端的條帶分別是每個(gè)涂層控制的三個(gè)涌（基材本身或聚氨酯涂層）。中間的條帶是DNA暴露在含核酸酶的涂層中的涌。當(dāng)暴露于含核酸酶的涂層表面時(shí)，盡管可以看到較小分解產(chǎn)物的涂片，不再檢測(cè)到明顯的條帶，表明DNA已被破壞。

圖8. 抗菌活性和使用AMP-7 /核酸酶涂層消除大腸桿菌對(duì)游離質(zhì)粒DNA 吸收。

此外，在圖8的右側(cè)，證明了在含有DNA的氨芐青霉素抗性基因暴露于核酸酶包被的表面之后，沒有發(fā)生抗生素抗性向大腸桿菌的轉(zhuǎn)移。此圖像中的瓊脂板添加了氨芐青霉素，只有能夠直接從表面提取DNA的大腸桿菌才能生長(zhǎng)（n=3：36、37和26個(gè)菌落）。但是，由于DNA被破壞，來自核酸酶涂層表面的大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素沒有產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致沒有菌落生長(zhǎng)（n=3：0、0和0菌落）。圖8的底部總結(jié)了整個(gè)過程。在細(xì)菌被AMP-7裂解并殺死后，游離DNA被被膜中的核酸酶降解，并且抗性基因未通過。

進(jìn)一步的涂料制造應(yīng)用以降低殺菌劑水平

在涂料制造領(lǐng)域，這些技術(shù)可進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍和市場(chǎng)領(lǐng)域，如外科手術(shù)式打擊般通過在涂層制造工藝流程中加入選定的生物添加劑，以減少在最終產(chǎn)品中摻入高含量殺菌劑的需求（圖9A）。通過使用前面提到的分子方法，可以快速識(shí)別源污染物，并在污染點(diǎn)用生物添加劑對(duì)設(shè)備線和材料進(jìn)行相應(yīng)處理。通過利用酶等生物分子和AMPs的可調(diào)性，這些試劑在植物中的靶向使用成為可能。

圖9A. 精確使用生物添加劑來控制微生物涂料的腐敗，在生產(chǎn)過程中確定污染點(diǎn)。

如圖9B所示，通過用生物添加劑保護(hù)劑覆蓋罐本身，這種保護(hù)可能會(huì)從工廠一直持續(xù)到消費(fèi)手中，而無需罐內(nèi)添加殺菌劑。罐壁和油漆/頂空界面處更容易接觸到氧氣，使微生物得以生長(zhǎng)，蓋子上的冷凝物堆積使這里成為另一個(gè)潛在的問題部位。

圖9B. 在容器上涂涂料以抑制所添加產(chǎn)品中的微生物生長(zhǎng)。

結(jié)論

總而言之，鑒于傳統(tǒng)殺菌劑使用所面臨的日益嚴(yán)峻的監(jiān)管挑戰(zhàn)，需要采取其他措